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免疫组化组织处理常见问题

发布时间:2013-3-18 14:05:41

一、免疫组化组织常用固定液 
1. 10%中性缓冲福尔马林固定液:40%甲醛10mL+0.01M pH7.4 PBS 90mL,此为国外推荐的免疫组化通用固定液。 
2. 4%多聚甲醛磷酸缓冲液:多聚甲醛40g与0.1M pH7.4 PB液500mL混合加热至60℃,搅拌并滴加1N NaOH至溶液清亮为止,冷却后加PB液至1000mL并充分混匀。 
3. B5(醋酸钠-升汞-甲醛)固定液:无水醋酸钠1.25g+升汞6.0g+蒸馏水90mL,三者混合,溶解,使用前加入40%甲醛10mL。本液多用于固定淋巴组织,染色前应进行脱汞沉淀处理。 
4. 95%乙醇。 
二、组织固定注意事项 
1. 手术或穿刺离体组织,应力求保持组织新鲜,勿使其干燥,尽快固定处理。 
2. 组织块大小以2cm×1.5cm×0.2-0.3cm为适,尤其厚度必须控制在0.3cm以内。 
3. 固定液的量必须足够,在体积上一般大于组织20倍以上。 
4. 固定时间,小标本为4-6h,大标本为18-24h或更久。但过度固定可降低抗原的活性。 
5. 组织固定后应充分水洗,以减少固定液造成的人为假象。 
三、石蜡切片要求   
    石蜡切片的优点是组织结构保存良好,能连续切片,组织结构清晰,抗原定位准确,在病理诊断和回顾性研究中有较大的实用价值。用于免疫组化的石蜡切片制备与常规HE制片略有不同: 
1、浸蜡、包埋过程中,石蜡应尽可能地保持在60℃以下。 
2、切片厚度3-5μm,淋巴和肾穿组织切片可更薄些。切出的蜡片应完整无缺,无刀痕、颤痕、皱褶、开裂,松解等。 
3、展片可采用二次展片法。 
4、载玻片必须经过防脱处理(迈新产品编号:SLI-2001)。 
备注:二次展片法是指在展片过程中,先将组织切片漂浮在30%-40%的乙醇溶液中,进行第一次展片,然后将切片捞起放入45℃-50℃的水浴锅中进行第二次展片。此法的优点是乙醇溶液与水之间有一个张力差,这样处理可得到平整无皱褶的组织切片,但像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织接触乙醇后会散开,不建议采用此法。乙醇的浓度和水浴锅中水的温度可视组织的不同和石蜡熔点的高低而作相应的调整。 
四、防脱片处理 
1. 载玻片的清洗:将载玻片浸泡在重铬酸钾洗液中24h,用自来水充分洗净,再用蒸馏水清洗两次以上,然后将载玻片浸泡在95%乙醇溶液中2h,取出后放入干燥箱烘干即可。 
2. 载玻片上涂防脱粘附剂:常用粘附剂为多聚-L-赖氨酸或APES,具体操作步骤见“防脱片剂使用方法”。 3. 检测载玻片是否清洗干净:将已清洗过的载玻片在即用型粘附剂溶液中沾一下,若载玻片洁净,在提取时,粘附剂呈一层均匀的水膜状覆盖在载玻片表面,若呈流水样流走,则表明载玻片没有清洗干净,需要重新清洗。 
免疫组化试剂贮存与使用须知 
为了有效地贮存免疫组化试剂,尽量延长试剂的使用寿命,请注意以下事项: 
1、收到试剂后,根据发货清单核对,若有误,请在3天内与本公司联系。 
2、核对后的试剂应尽快放入4℃冰箱贮存。 
3、凡购有浓缩试剂者,因为包装规格小,打开瓶盖之前请稍加离心,以便把试剂沉到瓶底,防止试剂粘在瓶盖上而造成浪费。 
4、在实验操作过程中,试剂使用完后及时将剩余的试剂放回原贮存处,试剂在室温下放置过久,效价容易下降,显色试剂在光亮条件下放置过久也容易失效。
建立免疫组化实验室常用设备