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免疫组化染色技术中常见问题、原因分析及解决方案

发布时间:2013-3-18 14:26:16

常见问题 原因分析 解决方案
染色阴性 阳性对照染色成立,受测组织染色阴性。 受测组织中没有受测抗原。 按染色阴性结果处理,无需重复实验。
阳性对照染色不成立,受测组织染色阴性。 抗原修复操作不当。如:①建议无需抗原修复,实际操作却进行抗原热修复(如迈新编号RAB-0090,HBcAg);②建议进行抗原酶消化修复,实际操作却进行抗原热修复或不修复(如迈新编号MAB-0280,MOC31)。 按照一抗说明书中建议的抗原修复方式,进行正确的抗原修复操作。
一抗与二抗检测系统种属匹配性错误。 根据一抗的种属正确选择匹配性的二抗检测系统。如受测组织为人体标本时,一抗为鼠抗,则二抗检测系统选择抗鼠或抗鼠/兔;一抗为兔抗,则二抗检测系统选择抗兔或抗鼠/兔。
实验操作中出现错误。如漏加某一试剂或试剂滴加顺序错误。 严格按照试剂说明书中建议的实验方法进行实验。
对于浓缩试剂而言,可能使用了不合格的稀释剂。一抗稀释剂偏酸时,会影响一抗与抗原的结合能力;二抗检测系统稀释剂中若含有叠氮钠等防腐剂时会影响二抗检测系统与一抗的结合能力。 使用合格的浓缩试剂稀释剂。
一抗选择错误,选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的一抗。 选择能用于石蜡包埋组织的一抗。
一抗、二抗检测系统、显色试剂被污染,失效或已超过有效期。 使用无污染,在有效期内且性能良好的试剂进行实验。
二抗检测系统与显色试剂不匹配。 根据二抗检测系统的种类,选择相应的显色试剂。如辣根过氧化物酶二抗检测系统可选择DAB、AEC显色试剂;碱性磷酸酶二抗检测系统可选择BCIP/NBT、AP/Red显色试剂等。
抗原含量过低。 使用放大效应更高的二抗检测系统进行实验。
试剂浓度过低、过高或不合适的孵育时间和温度。 选择浓度合适的试剂,按照说明书中建议的孵育方式进行实验。
水溶性色原显色后使用了含醇的复染液或用乙醇脱水、二甲苯透明(如AEC、BCIP/NBT、AP-Red等显色试剂)。 重新染色,并使用水溶性的复染液和封片剂。
染色弱 阳性对照染色成立,受测组织染色弱。 固定液使用不当,破坏了标本组织中的抗原。 查看一抗说明书或相关文献,使用推荐的固定液(如10%中性缓冲福尔马林固定液等)。
组织经固定和包埋等处理后抗原被破坏。 新鲜组织及时固定,防止其自溶;选择合适的固定液,固定时间应符合要求;使用低熔点的软蜡(58℃左右)包埋,包埋温度不超过60℃。
烤片温度过高或时间过长。 烤片温度以高于用于包埋的石蜡熔点3-5℃(或65-70℃)为适,烤片时间为1-2h。
受测组织中抗原含量低。 使用放大效应更高的二抗检测系统进行实验。
阳性对照和受测组织均为染色弱。 抗原修复方式不正确或遗漏。如修复时间、温度,修复液的pH值没有达到要求或要求进行抗原修复的却没有进行抗原修复等。 按照一抗说明书中建议的抗原修复方式进行抗原修复。修复过程要正确:修复温度,时间要达到要求,修复液选择恰当。
过氧化物酶阻断试剂阻断或血清封闭时间过长,试剂浓度不合适。 使用市售的即用型试剂并按照说明书中建议的孵育方式进行实验。
一抗、二抗检测系统、显色试剂浓度过高、过低或孵育时间过短。 调整试剂浓度或使用市售即用型试剂并按照说明书中建议的孵育方式进行实验。
使用已超过有效期的试剂。 使用有效期内性能良好的试剂进行实验。
孵育温度太低(低于15℃)。 延长孵育时间;或在37℃温箱内孵育,但应缩短孵育时间(30min)。
滴加试剂时,组织上的缓冲液(或血清)残留过多,导致试剂滴加后被稀释。 每次滴加试剂前将组织上的缓冲液(或血清)除去,但应防止组织干燥。
复染液复染过度。 复染时以细胞核淡染为适(不同类型苏木素配方不同,染色时间也不同,需优化染色时间)。
重复使用抗原修复液(可能导致修复液的pH值发生改变或夹杂杂质,进而影响抗原修复效果)。 每次使用新鲜配制的抗原修复液,并将其pH值调整至要求范围内。
显色试剂孵育时间过短或试剂配制错误(如配制DAB时,过氧化氢浓度不适或色原的量添加过量等)。 配制显色试剂时严格按照说明书中建议的使用方法执行;条件允许的话最好在显微镜下观察控制显色时间。
阳性对照染色成立,受测组织出现“阴阳脸”着色。 滴加试剂时,试剂未完全覆盖组织。 每次滴加试剂后,仔细检查一遍,确保试剂将组织完全覆盖。
实验操作台面不平或孵育盒不平,导致切片有个倾斜度,试剂滴加后将流向水平面低的一边,造成另一边的组织未被试剂覆盖或试剂很少,导致最终染色成“阴阳脸”结果。 实验时确保实验台面和孵育盒是水平的。
滴加试剂到组织上时存在气泡,却没有将气泡除去。 滴加试剂后再仔细检查一遍,若发现有气泡存在,务必将气泡除去。
组织固定时间过短,造成组织中心部位固定不足。 组织固定时间应达到标准要求。
背景染色 对照组织和受测组织,或在一些组织成分如脂肪、结缔组织和上皮组织中有背景染色。 切片脱蜡不彻底。 使用新鲜的二甲苯或其替代品进行脱蜡。
抗原修复过度。 严格控制抗原修复时间,温度;按照一抗说明书中建议的抗原修复方式执行或摸索出更适合自身实验室的抗原修复方式。
一抗浓度过高、孵育时间过长或孵育温度过高。 降低一抗浓度,缩短孵育时间,控制孵育温度。一抗孵育环境一般为:室温1h、4℃过夜或37℃30min(可根据实验室自身情况作相应调整)。
二抗检测系统浓度过高、孵育时间过长或孵育温度过高。 降低试剂浓度,按照试剂说明书中建议的孵育方式进行实验。
显色试剂孵育时间过长。 缩短显色试剂孵育时间,最好能在显微镜下观察控制显色时间。
PBS缓冲液重复使用多次或玻片冲洗不足。 每次使用新鲜的PBS缓冲液,玻片冲洗一定要充分,可在缓冲液中添加0.025-0.05%的Tween-20。
使用错误的封闭血清。 封闭血清一般与二抗检测系统种属相同,或者使用无血清蛋白封闭,但是不能选择与一抗种属相同的血清。
载玻片中粘附剂过厚。 重新配制粘附剂,制作新的防脱玻片。
受测组织和阴性试剂对照出现背景染色,而阳性和阴性组织对照染色成立。 组织固定不及时,造成部分抗原弥散并遗留在组织内。 组织及时固定。
取材时,由于使用钝的刀片,导致组织受到人为挤压而变形,血清蛋白弥散并遗留在组织内。 使用锋利的刀片取材。
受测组织有部分坏死、损伤或压迫成分。 观察染色结果时忽略此物理性损伤部分或重新取材。
组织切片太厚。 福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片厚度一般为3-5μm,冰冻切片不超过10μm。
阴性试剂对照不成立,而阳性、阴性组织对照和受测组织染色成立。 阴性对照血清浓度不合适。 使用浓度合适的阴性对照血清。对于单克隆抗体,阴性对照血清浓度稀释至其Ig含量与一抗相近;而对于多克隆抗体,则稀释至其蛋白含量与一抗相近。
阴性对照血清被污染并与受测组织中的蛋白发生交叉反应。 使用无污染的阴性对照血清进行实验。
对照染色成立,受测组织出现灶状背景染色。 裱片时水未排尽,在局部形成气泡使组织突起;实验过程中试剂滴加时渗入此区域后不易冲洗干净,导致染色过深。 裱片时务必将水排尽。
用于裱片的水浴锅中的水质被细菌或酵母菌等污染。 定期清洁水浴锅并保证每次使用干净的水。
制作APES防脱玻片时,APES的浓度过高,干燥后在玻片上留下白色小点,显色时白色小点着色。 严格按照试剂说明书中建议的使用方法制备防脱玻片。
组织切片有皱褶、撕裂、刀痕等,造成实验过程中试剂没有被彻底冲洗干净,进而导致染色过深。 确保受测组织切片完整,不出现皱褶、撕裂、刀痕等。
对照染色成立,受测组织出现边缘效应。 组织边缘与玻片黏贴不牢,经抗原热修复或后续缓冲液冲洗后,造成边缘组织松脱浮在玻片上方,每次冲洗时不易将组织下面的试剂洗净,进而导致此区域染色过深。 组织前期处理(特别是脱水环节)应规范,切片厚度适中,使用防脱性能良好的玻片,冲洗时不要对着组织冲洗。
滴加试剂时,试剂未充分覆盖组织,导致组织边缘无试剂或试剂很少,孵育时此区域容易首先变干,造成浓度较中心组织高而导致染色过深。 每次滴加试剂时务必使试剂充分覆盖组织(可在滴加试剂前在离组织边缘3mm处用免疫组化油笔画圈)。
对照染色成立,受测组织出现非特异的细胞核着色。 组织前期处理不适当,如组织在二甲苯中浸泡时间过长,固定液使用不当;组织变干,抗原修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液蒸发过多,造成最后部分组织没有浸泡在修复液中。 严格按照标准操作规程进行操作。
使用生物素二抗检测系统时,组织中内源性生物素显色。 这种非特异性显色通常发生在高代谢器官组织中,当组织切片进行抗原热修复后,组织中所含的内源性生物素同生物素二抗检测系统中的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶发生链接而造成非特异性显色,显色多定位于胞浆中,且迷惑性极大。 使用内源性生物素阻断试剂进行阻断;或者使用非生物素二抗检测系统,如迈新的MaxVisionTM、MaxVisionTM 2、EliVisionTM plus、EliVisionTM Super。
使用辣根过氧化物酶二抗检测系统时,组织中内源性过氧化物酶显色。 这种显色通常发生在红细胞、坏死组织、炎症细胞中。是由于组织中所含的过氧化物酶没有用相应阻断试剂阻断或阻断不完全。 使用过氧化物酶阻断试剂阻断,适当延长阻断时间;或者使用碱性磷酸酶二抗检测系统。
组织脱片 组织处理和蜡块选择不当。 按照《临床技术操作规范 病理学分册》进行组织处理,脱水彻底,尽量不选择脂肪多的组织。 
载玻片防脱功能差。  使用防脱功能好的载玻片。
抗原修复不正确,如修复过度或修复结束后迅速冷却等。  按照一抗说明书中建议的抗原修复方式,进行正确的抗原修复操作。 
组织切片太厚、不均匀、皱褶等。  组织切片厚度为3-5μm,切片完整,均匀,无皱褶等。 
烤片条件:温度过低、时间过短等。  烤片温度以高于用于包埋的石蜡熔点3-5℃(或65-70℃)为适,烤片时间为1-2h。
冲洗方式不正确,如对着组织冲洗。  掌握正确的冲洗方式。